共聚焦显微可以呈现这么漂亮的图像,是不是什么样品都可以用共聚焦显微镜拍拍拍.....得到各种各样清晰漂亮的图像呢?答案是否定的,任何事物都有优缺点,何况一台仪器呢,共聚焦显微镜也是有自己的局限,共聚焦有哪些局限呢:1.共聚焦显微镜只能拍摄约200um以内的的样品,对于厚的或者样品不能进拍摄;2.共聚焦显微镜由于是逐点进行扫描,对样品的光毒性还是比较大的,特别是拍摄活细胞样品时就更容易对样品进行淬灭;3.由于光照射的区域几乎能通过这个Z轴的层面,所以对于空间定点光刺激的实验定点位置就不是特别精确;并且激光共聚焦显微镜没有纯紫外进行激发,对于一些特殊激发波长的实验,效率非常低。双光子显微镜的基本原理是:在高光子密度的情况下,荧光分子可以同时吸收2个长波长的光子,在经过一个很短的所谓激发态寿命的时间后,发射出一个波长较短的光子;其效果和使用一个波长为长波长一半的光子去激发荧光分子是相同的。双光子激发需要很高的光子密度,为了不损伤细胞,双光子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器。这种激光器发出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量,其脉冲宽度只有100飞秒,而其周期可以达到80至100兆赫兹。双光子显微镜可以在小鼠的的任何部位进行有生命体成像。国外布鲁克双光子显微镜授权商
双光子显微镜是激光扫描共聚焦显微镜和双光子激发技术相结合的新技术。双光子激发的基本原理是:在光子密度较高的情况下,荧光分子可以同时吸收两个波长较长的光子,经过短暂的所谓激发态寿命后,发射一个波长较短的光子;效果和用波长为长波长一半的光子激发荧光分子是一样的。双(多)光子成像的优点是具有更深的组织穿透深度,红外光可以在平面上探测到极限为1mm的组织区域;因为信号背景比高,所以具有更高的对比度;由于激发体积小,具有定点激发、光毒性小的特点;激发波长由紫外、可见光调整为红外激发,更加安全。国外双光子显微镜厂家双光子显微镜型号有哪些?
在深度组织中以较长时间对活细胞成像,双光子显微镜是当前之选。双光子和共聚焦显微镜都是通过激光激发样品中的荧光标记,使用探测器测量被激发的荧光。但是,共聚焦一般使用单模光纤耦合激光器,通过单光子激发荧光,而双光子使用飞秒激光器,通过几乎同时吸收两个长波光子激发荧光。双光子激发荧光的主要优势:双光子比共聚焦使用的更长的波长,所以对组织的损伤更小且穿透更深。共聚焦的成像深度一般为100微米,双光子则能达到250到500微米,甚至超过1毫米。另外,同时吸收两个光子意味只有度聚焦点处能被激发,所以不会损伤焦平面之外的组织,并且生成更清晰的图像。
像差问题一直困扰着光学领域的工作者。像差会使光波前发生形变,不仅降低成像的信噪比和分辨率,使得很多时候我们只能“雾里看花”,更甚者,产生赝像,或无法获得有意义的图像。像差问题对双光子成像的影响尤为严重,因为在那里,荧光信号对入射光强度的依赖是平方关系,一旦入射光波前形变,不仅聚焦强度大幅下降,成像分辨率也急剧恶化。因此,如何解决像差问题,实现,例如小鼠大脑皮层,深层区域的高质量成像成为光学成像发展中相当有挑战性的问题之一。双光子显微镜明日之星--FemtoFiber ultra 920 。
掺杂可以明显影响碳点(CDs)的发射和激发特性,使双光子碳点(TP-CDs)具有本征双光子激发特性和605nm的红光发射特性。在638nm激光照射下,除了长波激发和发射外,还可以实现活性氧(ROS)的产生,这为光动力技术提供了巨大的可能性。更重要的是,通过各种表征和理论模拟证实,掺杂诱导的N杂环在TP-CDs与RNA的亲和力中起关键作用。这种亲和力不仅为实现核仁特异性自我靶向提供了可能,而且通过ROS断裂RNA链解离TP-CDs@RNA复合物,赋予治疗过程中的荧光变异。TP-CDs结合了ROS的产生能力、光动力疗法(PDT)过程中的荧光变化、长波激发和发射特性以及核仁的特异性自靶向性,可以认为是一种结合核仁动态变化实时处理的智能CDs。双光子显微镜观察到的现象证明了钙离子的增加依赖于肌体触发的钠离子作用电势。双光子显微镜ultima2PPLUS
双光子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器。国外布鲁克双光子显微镜授权商
在高光子密度的情况下,荧光分子可以同时吸收两个长波长的光子,然后发射出一个波长较短的光子,其效果和使用一个波长为长波长一半的光子去激发荧光分子是相同的如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH),在单光子激发时,在波长为350nm光的激发下发出450nm荧光;而在双光子激发时,可采用700nm的激发光得到450nm荧光。由于双光子激发需要很高的光子密度,为了不损伤细胞,双光子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器。这种激光器发出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量,从而可以减少光漂白和光毒性带来的不利影响。国外布鲁克双光子显微镜授权商