多束扫描技术可以同时对神经元组织的不同位置进行成像对两个远距离（相距大于1-2mm）的成像部位，通常使用两条单独的路径进行成像；对于相邻区域，通常使用单个物镜的多光束进行成像。多光束扫描技术必须特别注意激发光束之间的串扰问题，这个问题可以通过事后光源分离方法或时空复用方法来解决。事后光源分离方法指的是用算法来分离光束消除串扰；时空复用方法指的是同时使用多个激发光束，每个光束的脉冲在时间上延迟，这样就可以暂时分离被不同光束激发的单个荧光信号。引入越多路光束就可以对越多的神经元进行成像，但是多路光束会导致荧光衰减时间的重叠增加，从而限制了区分信号源的能力；并且多路复用对电子设备的工作速率有很高的要求；大量的光束也需要更高的激光功率来维持近似单光束的信噪比，这会容易导致组织损伤。多光子激光扫描显微镜采用波长较长的红外激光,能量脉冲式激发,红外光比可见光在生物组织中的穿透力更强。美国多光子显微镜单分子成像定位
对于双光子（2P）成像而言，离焦和近表面荧光激发是两个比较大的深度限制因素，而对于三光子（3P）成像这两个问题大大减小，但是三光子成像由于荧光团的吸收截面比2P要小得多，所以需要更高数量级的脉冲能量才能获得与2P激发的相同强度的荧光信号。功能性3P显微镜比结构性3P显微镜的要求更高，它需要更快速的扫描，以便及时采样神经元活动；需要更高的脉冲能量，以便在每个像素停留时间内收集足够的信号。复杂的行为通常涉及到大型的大脑神经网络，该网络既具有局部的连接又具有远程的连接。要想将神经元活动与行为联系起来，需要同时监控非常庞大且分布普遍的神经元的活动，大脑中的神经网络会在几十毫秒内处理传入的刺激，要想了解这种快速的神经元动力学，就需要MPM具备对神经元进行快速成像的能力。快速MPM方法可分为单束扫描技术和多束扫描技术。美国清醒动物多光子显微镜实验操作多光子激光扫描显微镜更能解决生物组织中深层物质的层析成像问题, 扩大了应用范围。
随着现代分子生物学技术的快速发展和科学技术的进步，特别是后基因组时代的到来，人们已经能够根据需要建立各种细胞模型，这为在体内研究基因表达、分子间相互作用、细胞增殖、细胞信号转导、诱导分化、细胞凋亡和新生血管生成提供了良好的生物学条件。然而，尽管利用现有的分子生物学方法对基因表达与蛋白质的相互作用进行了深入细致的研究，但仍然无法实现对蛋白质和基因活性的实时动态监测。在细胞的生理过程中，基因尤其是蛋白质的表达、修饰和相互作用往往是可逆的、动态变化的。目前，分子生物学方法无法捕捉到蛋白质和基因的这些变化，但获得这些信息对于研究基因表达与蛋白质的相互作用非常重要。因此，有必要发展一种动态、实时、连续监测蛋白质和基因活性的方法。
单束扫描技术可以高速遍历大视场（FOV）的神经组织：使用MPM对神经元进行成像时，通过随机访问扫描—即激光束在整个视场上的任意选定点上进行快速扫描—可以只扫描感兴趣的神经元，这样不仅避免扫描到任何未标记的神经纤维，还可以优化激光束的扫描时间。随机访问扫描（图1）可以通过声光偏转器（AOD）来实现，其原理是将具有一个射频信号的压电传感器粘在合适的晶体上，所产生的声波引起周期性的折射率光栅，激光束通过光栅时发生衍射。通过射频电信号调控声波的强度和频率从而可以改变衍射光的强度和方向，这样使用1个AOD就可以实现一维横向的任意点扫描，利用1对AOD，结合其他轴向扫描技术可实现3D的随机访问扫描。但是该技术对样本的运动很敏感，易出现运动伪影。目前，快速光栅扫描即在FOV中进行逐行扫描，由于利用算法可以轻松解决运动伪影而被普遍的使用。滔博生物-三维显微镜-适用于各行各业的观察需求!
当激光光束焦点的位置在镜面上，此时被反射的激光在无限空间中成为准直光束，并在OBJ2的焦平面上形成了一个激光光斑。同理，如果横向扫描光束，则会形成远离倾斜镜镜面的焦点，这又导致返回的光束会聚或发散，进而OBJ2能在轴向不同位置形成焦点，通过这种方式即能实现连续的轴向扫描。对于较小的倾斜角，聚焦没有球差。该组在实验中表征了这种将横向扫描转换为轴向扫描技术的光学性能，并使用它将光片显微镜的成像速度提升了一个数量级，从而可以在三个维度上量化快速的囊泡动力学。该组还演示了使用双光子光栅扫描显微镜以12kHz进行共振远程聚焦，该技术可对大脑组织和斑马鱼心脏动力学进行快速成像，并具有衍射极限的分辨率。生产和消费的角度分析多光子显微镜的主要生产地区、主要消费地区以及主要的生产商。美国离体多光子显微镜成像分辨率
从双光子到三光子甚至四光子，这种非线性成像技术通常也被统称为多光子显微镜。美国多光子显微镜单分子成像定位
现代分子生物学技术的迅速发展和科技的进步，特别是随着后基因组时代的到来，人们已经能够根据需要建立各种细胞模型，为在体研究基因表达规律、分子间的相互作用、细胞的增殖、细胞信号转导、诱导分化、细胞凋亡以及新的血管生成等提供了良好的生物学条件。然而，尽管人们利用现有的分子生物学方法，已经对基因表达和蛋白质之间的相互作用进行了深入、细致的研究，但仍然不能实现对蛋白质和基因活动的实时、动态监测。在细胞的生理过程中，基因、尤其是蛋白质的表达、修饰和相万作用往往发生可逆的、动态的变化。目前的分子生物学方法还不能捕获到蛋白质和基因的这些变化，但获取这些信息对与研究基因的表达和蛋白质之间的相互作用又至关重要。因此，发展能用于、动态、实时、连续监测蛋白质和基因活动的方法是非常有必要的。美国多光子显微镜单分子成像定位
